實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出

由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它

有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣

泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求;

熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。

PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行

5、必須在無菌無塵環境下進行操作

這個區域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區。

該去專門用于準備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

4、PCR實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

5、在前PCR區建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。

7、后PCR區PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動